Strategi cloning DNA
Menghasilkan fragment-fragment DNA asing
Insersi DNA asing kedalam vector
Transformasi molekul DNA recombinant kedalam sel inang yang dapat melakukan replikasi
Methode seleksi atau screening clone :untuk mengidentifikasi gen yang mengandung rekombinan partikular yang dimaksudkan.
Pustaka DNA (DNA library)
Merupakan koleksi dari fragment DNA
Tipe library: genomic DNA library atau complement DNA (cDNA)
Genomic libraries mengandung fragments dari semua sekuen DNA sequences yang ada dalam genome.
cDNA libraries mengandung kopi DNA dari mRNA dan mengandung jaringan dan developmental stage yang specific. Formasinya tergantung pada RNA-dependent DNA polymerase enzyme, dan reverse transcriptase.
Genomic Library (1)
Mengandung representative copies dari semua materi genetik dari organisme individu.
Library yang dikonstruk dari jaringan apapun dari dalam individu tunggal yang mengandung fragmen DNA yang sama dimanapun walaupun diambil dari jaringan yang berbeda
Genomic libraries mengandung semua sekuen DNA: expressed genes, non-expressed genes, exons and introns, promoter and terminator regions and intervening DNA sequences.
Genomic Library (2)
Method fragmentasi berperan penting dalam menentukan kualitas library
Idealnya, genomic DNA harus dipecah kedalam fragment acak dan overlaping untuk kloning. Pemecahan harus menjamin bahwa library mengandung kopi yang mewakili semua fragmen DNA dalam genome
Terdapat 2 mekanisme dasar untuk cleaving DNA yang digunakan dalam konstruksi genomic libraries: Mechanical shearing dan Restriction enzyme digestion.
Genomic Library (3)
Mechanical shearing. Genomic DNA yang dimurnikan dilewatkan beberapa kali melalui “narrow-gauge syringe needle” atau sonikasi untuk memecah DNA menjadi fragmen ukuran yang cocok yang dapat dikloning.
Rata-rata ukuran DNA fragment :20 kbp untuk cloning dalam vector berbasis λ
Metode mekanis memiliki keuntungan bahwa fragmentasi DNA secara acak rata-rata ukuran fragmentasi DNA cukup bervariasi.
Genomic Library (4)
Restriction enzyme digestion: menggunakan enzim untuk memperoleh fragmen DNA
Kekurangan : memungkinkan gen terpotong sekali atau berulang sehingga tidak diperoleh fragmen tunggal, terjadi pemotongan parsial atau fragmen menjadi terlalu kecil untuk dikloning. Contoh enzim EcoRI mengenali 6 bp DNA sequences dan memotong DNA dalam sekuen yang dikenali. Rata-rata, 6 bp DNA sequence akan terjadi kira-kira setiap 4000 bp dalam DNA. Pemotongan DNA genom dengan EcoRI menghasilkan fragmen DNA yang terlalu kecil untuk konstruksi genimic library.
Untuk mengatasi kekurangan: menggunakan enzyme restriksi beberapa enzim yang mengenali dan memotong sekuen yang umum.
Konstruksi Genomic DNA Library
Genomic DNA dengan berat molekul tinggi secara parsial dapat dipecah dengan campuran enzim restriksi enzymes HaeIII and AluI. Tiap enzim ini mengenali 4 bp DNA sequence, sehingga rata-rata pengenalan terjadi tiap 256 bp dalam genomic DNA. Pemotongan parsial membatasi jumlah site enzim restriksi yang memotong dan memicu formasi fragmen DNA genom yang berukuran tepat untuk dikloning
Fragmen DNA yang dihasilkan dengan cara ini memiliki ujung yang tumpul (blunt end) (ligasi sticky ended DNA (Ujung DNA berbentuk untuk berpasangan) lebih efisien dibandingkan ujung tumpul). Karena itu ujung tumpul DNA diubah dengan lingkers/adaptor atau menggunakan enzym restriksi yang menghasilkan sticky ends (Sau3AI, BamHI).
Lingker/adaptor: ujung tumpul fragment DNA diligasi dengan serangkaian oligonucleotides yang masing-masing mengandung sekuen pengenal untuk enzim restriksi (linkers) atau memiliki satu blunt end untuk ligasi ke genomic DNA dan ujung satunya berbentuk sticky end untuk cloning menjadi particular restriction sites (adaptors). Dalam kasus ini, DNA fragments diproteksi dari enzim restriksi pembelah dengan DNA methylase spesifik (EcoRI methylase). Keberadaan S-adenosyl methoinine akan menghasilkan metilasi internal (hampir semua residu dalam sekuen pengenal EcoRI (5-GAATTC-3).
Oligonucleotide linkers kemudian ditambahkan pada methylated DNA secara berlebih dalam konsentrasi tinggi DNA ligase. Perlakuan selanjutnya dengan enzim restriksi EcoRI akan menghasilkan pemecahan DNA hanya pada molekul linker yang hanya satu mengandung sekuen pengenal enzim restriksi EcoRI non-metilasi. Fragmen yang dihasilkan selanjutnya diklon dalam site restriksi EcoRI dari vektor yang tepat.
Setelah DNA fragments dihasilkan selanjutnya diklon dalam vektor yang tepat (sering menggunakan vektor berbasis λ (λ based vector).
Vector recombinant dan kombinasi yang diinsertkan ditumbuhkan dalam E. coli sehingga koloni tunggal bakteri atau viral plaque meningkat dari ligasi fragment DNA genoom tunggal kedalam vector sel E. coli yang terinfeksi λ phage atau tertrasformasi dengan plasmid DNA tidak mampu mendukung replikasi dari DNA molekul dari tipe yang sama sehingga setiap λ plaque atau koloni bakteri mengandung kopi berganda dari molekul DNA rekombinan yang sama.
Library dari molekul ini dihasilkan dari pemilihan koloni atau plaques yang positif mengandung fragmen DNA genom.
Jumlah individual colonies atau plaques yang diapat dianggap mewakili DNA genom tergantung pada ukuran rata-rata fragmen klon DNA dalam library. Contoh jika library E. coli genom (4.6 Mbp) yang dikonstruksi mengandung 5 kbp fragments maka fraksi ukuran genom dibadingkan dengan rata-rata ukuran fragmen klon individual (f ) maka jumlah terendah dari klon dalam library adalah:
f = genome size = 4600000 bp = 920
fragment size 5000 bp
cDNA library
Kloning cDNA diawali dengan pencampuran oligonucleotida pendek (12–18 base) dari dT dengan mRNA yang dimurnikan dimana oligonucleotide akan mengeannealing ujung polyA dari molekul RNA. Reverse transcriptase selanjutnya ditambahkan dan menggunakan oligo-dT sebagai primer untuk mensintesa single strand cDNA dalam keberadaan 4 deoxynucleotide triphosphates (dNTPs).
Molekul yang dihasilkan berupa double-stranded hybrids, satu molekul cDNA dan satu molekul mRNA. Oligo dT primer digunakan untuk membuat cDNA strand sehingga akan memiliki ujung heterologous. Primer dapat memasangkan sejumlah posisi melalui polyA tail dan akibatnya menghasilkan fragmen cDNA dengan panjang berbeda yang mungkin diturunkan dari molekul mRNA yang sama. Untuk mengatasi masalah ini, anchored oligo dT primer sering digunakan. Dengan penambahan 12–18 base dT sequence primer anchore dapat dikonstruksi sehingga ujung 3- mengandung residu G, A, atau C. Primer tersebut (5-T12–18V-3, dimana V = G, A, atau C) hanya akan efisien mengawali repikasi DNA jika dipasangkan dengan ujung 5- dati polyA tail, dimana residu G, A, atau C akan berpasangan dengan nucleotida.
Production second DNA strand seperti replikasi DNA membutuhkan primer untuk mengawali sintesa DNA yang dikaitkan dengan ujung 5- dari mRNA.
Pengklonan cDNA yang efisien,mRNA digabungkan dengan plasmid DNA linier dan memiliki ekor oligo dT yang kemudian menjadi primer sintesis cDNA strand yang pertama. Ekor oligo-dG ditambahkan pada molekul plasmid cDNA yang kemudian disentrifugasi melalui gradien sukrose bersifat basa.Langkah ini menghilangkan molekul-kecil-kecil menghidrolisis mRNA dan memisahkan ke-2 cDNA yang pada mulanya melekat pada plasmid dupleks yang sama. Setelah terdenaturalisasi,ditambahkan DNA plasmid berekor olego-dC (dalam jumlah berlebih) dan kondisinya disesuaikan agar terjadi sirkulasi dengan ekor homopolimer yang komplementer. Plasmid berekor oligo-dC yang berlebih mungkin hanya mengalami renaturasi tetapi tidak dapat mengadakan sirkulasi. Molekul-molekul lingkar memiliki gugus 3-hidroksil yang bebas pada ekor oligo-dC yang menjadi primer bagi sintesa unting ke-2 cDNA untuk menciptakan plasmid rekombinan dupleks yang mentrasformasi E.coli.Klon-klon dapat diperoleh dengan menyisipkan cDNA pada kedua orientasi.
0 komentar: